細胞培養(yǎng)過程中細胞老化是一個不可避免的現(xiàn)象。延緩細胞老化過程,提高細胞傳代過程中的活力,對于永生化細胞獲得,干細胞傳代以及轉(zhuǎn)基因陽性細胞的篩選具有重要意義。自噬是細胞內(nèi)自我修復的機制之一,保持細胞代謝的均衡,并參與細胞老化等細胞生長發(fā)育的過程。研究證明自噬在延緩細胞老化方面起重要作用。在老化進程中自噬水平下降,且自噬下降會加速老化進程,同時自噬水平升高可以延緩老化的速度。改善自噬水平延緩細胞老化已成為一個熱點科學問題,受到各國科學者們的重視,對細胞遺傳資源保護以及改善與老化相關(guān)疾病都具有重要意義。雷帕霉素是一種免疫抑制劑,可以抑制mTOR,誘導和促進細胞自噬的發(fā)生。本研究利用雷帕霉素處理成年牛皮膚成纖維細胞,旨在通過促進細胞自噬,改善成體成纖維細胞老化的現(xiàn)象,延長細胞壽命,以期保護其遺傳資源,同時也為核移植等提供理想的生物學材料。本研究對于傳代到第13代發(fā)生老化的成年牛成纖維細胞用雷帕霉素(RAPA)進行處理。檢測與細胞老化有關(guān)基因CDKN2A、CDKN1A的表達以及β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性,觀察了細胞內(nèi)自噬小體形態(tài)的變化,并通過轉(zhuǎn)染pEX-GFP-hLC3 WT質(zhì)粒觀察細胞中...

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1:細胞自噬的形成過程

自噬過程的發(fā)生經(jīng)歷了四個階段,自噬泡的初始產(chǎn)生、自噬體的形成、自噬的轉(zhuǎn)運融合、自噬的降解(Jinetal.2014)。自噬泡的形成:在外界刺激因子作用下,在細胞內(nèi)受損的線粒體等物質(zhì)周圍有杯狀形的雙層膜結(jié)構(gòu)初步形成。自噬體的形成:自噬過程始于細胞質(zhì)成分的隔離,其中細胞質(zhì)的某些部....

圖1-2:雷帕霉素的化學結(jié)構(gòu)

雷帕霉素的化學分子式為C51H79NO13,分子量914.172g/mol,熔點為183-185℃,為白色固體結(jié)晶,親脂性,溶解于有機溶劑,極微溶于水,幾乎不溶于乙醚。1.4.2雷帕霉素作用機制

圖1-3:細胞mTOR信號通路

現(xiàn)已被科學家發(fā)現(xiàn),雷帕霉素能誘導細胞發(fā)生自噬作用(吳伯艷等2015)11。研究表明,雷帕霉素能在體內(nèi)和體外通過抑制靶蛋白(mTOR)激酶的活性從而激活細胞自噬(Graziottoetal.2012;Garrattetal.2016)。雷帕霉素與FK506結(jié)合蛋白12形成復....

圖2-1 P1與P14成纖維細胞的生長曲線

第一代的牛皮膚成纖維細胞和第14代的成纖維細胞的生長趨勢均符合細胞體外生長的一般規(guī)律,都為S形曲線。第1-3天為潛伏期,細胞生長緩慢;第3-5天為對數(shù)生長期,細胞生長迅速,數(shù)量明顯增多;5天之后細胞進入平臺期,基本不再生長。繪制兩組細胞的生長曲線,結(jié)果顯示,與P1細胞相比,P14....

本文編號：4048666